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Lychix彩科生物 | 破譯中心法則:從單細胞單組學到多組學

2022-11-22 10:43


有機體的生命活動需要不同器官或組織的協調來執行相應功能,在生命的基本單元—單個細胞中,細胞活動的過程也由一系列信號轉導的分子事件控制。信號轉導過程是由蛋白激酶和蛋白酶進行的一系列磷酸化和去磷酸化引起的細胞活動事件。此外,不同器官之間通過信使分子進行的協調本質上也是蛋白質,蛋白質是生命活動的執行者。合成具有獨特氨基酸序列的蛋白質的信息由存在于細胞核內的核酸所編碼。在預設特定的氨基酸序列中,存在于細胞核中的 DNA 會產生特定的 信使RNA 序列,進而引導細胞機器合成對應序列的蛋白質。


1958 年,Francis Crick在發現DNA雙螺旋之后,提出了中心法則概念,“The central dogma of molecular biology deals with the detailed residue-by-residue transfer of sequential information. It states that such information cannot be transferred back from protein to either protein or nucleic acid”。分子生物學的中心法則解釋了遺傳信息的流動,從DNA到RNA,再到蛋白質,也包括信息不會從蛋白質流向核酸的概念,當然近些年這也有幾個例外,中心法則的內容也在不斷更新完善中。



法則各環節引百家爭鳴


中心法則的每一個環節,都吸引生物學家們不斷探索,遺傳信息的復制,轉錄,翻譯,調控,從基因組學到轉錄組學,再到蛋白組學和代謝組學,從組織器官到細胞群體再到單個細胞研究。作為生命活動的基本結構單元,單個細胞是研究中心法則的**模型。不同組織的細胞結構和功能迥異,同一組織的細胞雖然結構功能類似,通過單個細胞的組學研究,依然具有多樣的異質性。探索中心法則的組學技術發展,依賴于兩條技術路線,一條依賴于核酸捕獲擴增,反轉錄,蛋白檢測等分子生物學,免疫學技術的升級,另一條是細胞分隔,從手工操作低通量到自動化高通量并行技術的發展。


單細胞基因組學—分子生物學不斷突破

單細胞基因組學非常好的詮釋了分子生物學技術的不斷進步對單個細胞水平上研究細胞間基因組變異和功能理解的全面性。單細胞基因組的技術關鍵在于無偏差的對全基因組進行擴增(whole – genome amplification WGA),通過對引物的優化創新,和新的工具酶的挖掘,以及擴增條件的新策略,單細胞基因組的捕獲效率逐漸升高,包括1992年開始的依賴含有15個堿基的隨機引物的PEA技術,以及采用含有6個隨機引物的兼并序列引物的DOP-PCR,到2003年基于phi29DNA聚合酶的MDA方法,2012年Sunny Xie開發的MALBAC技術,后來基于Tn5轉座子的LIANTI技術,減少了非特異擴增和指數擴增,大大降低了擴增偏差,促進了腫瘤研究和臨床診斷,尤其是循環腫瘤細胞的分析,對胚胎發育的研究,神經元的理解都有重要作用。



單細胞轉錄組學

——生物學和微流控交叉的典范

單細胞轉錄組學的發展則向我們展現了分子技術和微流控技術交錯更迭,相互促進的優秀風貌。在cDNA的擴增上,經歷了從末端加尾、體外逆轉錄到模板置換的方法發展,2006年,通過 Oligo-dT 引物反轉單個細胞中的 mRNA 獲得一鏈 cDNA,再使用末端加 A 的策略獲得雙鏈 cDNA,由于當時還沒有二代測序,使用基因芯片雜交獲得了轉錄本的信息,2009年,湯富酬教授沿用了該策略,配合SOLID 測序平臺,完成了**個正真意義上的單細胞測序,隨后拉開了單細胞轉錄組測序的浪潮。一方面是對末端加尾方法的優化,如Quartz-seq,另一方面是對新的高效二鏈合成方法的開發如CEL-seq,Smart-seq,以及Barcode和UMI的策略讓高通量成為可能,從Quartz-seq到Quartz-seq2?;赥SO的模板末端置換法依賴于其高效簡便的二鏈合成方案,如今已經成為cDNA擴增的主流技術。



當一項組學技術其重要性得到生物學家們的認識后,人們開始利用材料學,微流控等交叉技術構建新的高通量平臺。15年以前,單細胞轉錄組測序還僅僅是在96/384孔板中進行,基于油包水的微流控芯片技術和Barcode以及UMI的巧妙結合,讓高通量單細胞轉錄組學大放異彩,在10XGenomics進入**市場之后,單細胞轉錄組學的應用文章如雨后春筍般涌現。單細胞轉錄組學的本質是對每個細胞都打上****的標簽,利用標簽區分每個細胞中的轉錄組信息。同時基于Microwell的單細胞轉錄組學技術同樣有其一席之地。另外,SPLiT-seq技術以細胞為反應腔室,通過固定細胞打孔,進行多輪split-and-pool的方案在96孔板上就可以實現高通量的單細胞轉錄組分析。單細胞轉錄組方法在高通量的發展過程中,隔離腔室引物配對經歷了從顯微操作、96/384 孔板到油包水滴,再到納米微孔以及固定細胞內腔的發展,在通量和可行性提高的同時,成本也逐漸下降,目前已經成為腫瘤,免疫,發育等多個應用領域的標配。


單細胞蛋白組學—依賴技術創新

考慮到蛋白質是生命活動的執行者,對于蛋白質的檢測,在生物學上則較為清晰,大體基于抗原抗體結合的Assay或者基于質譜的分析。而想要在單細胞水平上進行蛋白組學方面的研究,則依賴于流式,微流控等平臺的整合和創新。通過抗體偶聯熒光標簽,對細胞的表面蛋白和部分胞內蛋白檢測,而全光譜染料的出現和金屬標簽修飾抗體的加入,擴大了單個細胞可以檢測蛋白的種類數量,此外還有單細胞Western等技術。這些都是基于細胞本身的蛋白表征,而細胞分泌的產物同樣是細胞非常重要的功能指標和細胞間信息傳遞的要素。Isoplexis的單細胞平臺利用蛋白條碼標簽可以實現單個細胞多個分泌物質的檢測。



破譯中心法則需論因果

從受精卵到一個生物個體的發育,即起源于一套遺傳物質,但卻能分化為形態各異,功能多樣的細胞類型,而每一種細胞類型通過遺傳物質的調控以及和環境的互作,最終形成了組織和器官等復雜結構和功能,這便是中心法則的魅力。中心法則是一個動態調控的連續過程,單一組學反應了某個時間點下細胞某一層面的信息,這一層面的信息對于細胞來說,要么是因,要么是果,而因果很難聯系。比如單細胞轉錄組學,發表的文章大多是組織器官,微環境等表達圖譜或者細胞聚類文章,我們知道了某個器官或者疾病類型表達圖譜,或者細胞類型,這是因,然后由于缺乏后續蛋白質等層面的功能分析,很難在實際研發生產中有所建樹。故大多數單一組學的數據都沉睡在不同影響因子的文章里,單細胞轉錄組學既沒有在臨床診斷中有所發現,也沒有在藥物靶點發現上廣泛應用,而只是體現在了文章的影響因子上,隨著文章越來越多,這一發文捷徑也昭然若揭,不再起效。


即獲得因,又拿到對應的果,則要求我們能夠同時獲得中心法則中各個層面的信息,即單細胞多組學的核心需求。而商家是最早嗅到這一商機的,10xGenomics和MissionBio都推出了基于Total-seq的蛋白聯合轉錄組或基因組的技術,10xGenomics 的 Single Cell Multiome ATAC + Gene expression也已經上市,BD同樣推出了結合單細胞測序的多組學平臺,同時,2022年6月,率先將光譜流式細胞術與可分選成像相結合推出新品BD FACSDiscoverTM S8 細胞分選儀。通過整合光譜流式細胞術與實時空間和形態學信息,將細胞分析和分選的能力擴展到新維度而廣受追捧。2021年于荷蘭創立的UFO Biosciences,篩選、識別、分離和分析單細胞的服務,以找到真正有意義的基因。UFO Biosciences 革命性功能性單細胞測序技術的基礎工作發表在 Nature Biomedical Engineering。功能性單細胞測序可以在單細胞水平上將細胞表型與其驅動基因型直接聯系起來。通過對大量細胞的實時行為顯微成像分析,我們可以識別出表現攻擊性行為的異常細胞。我們可以挑選并測序以了解驅動這些侵襲性細胞特定表型的分子途徑。細胞的攻擊行為是果,侵襲性細胞的驅動基因是因,因果聯系,再遇到同樣的果,就能從源頭通過改變因來達到效果。



組學已至,聯動在技

以上舉到的例子,有膜蛋白和基因組,轉錄組聯系的,有細胞成像行為和膜蛋白的聯系或者和轉錄組的聯系,局限于技術的法則,這些信息往往呈現某個局部特征,很難從中心法則的全局上獲得較為全面的聯動數據。


然而,尷尬的是中心法則的每一層的技術,不管是基因組,轉錄組,蛋白組,細胞功能成像等,我們都有非常完備的方法獨立獲得,**要做的是將他們聯系起來。前面提到,當生物學技術足夠完善的時候,想要突破,就需要依賴于交叉學科例如微流控,材料,化學等多方面的結合。拿到單個細胞的每一個層面的信息非常簡單,而想要將他們聯系起來,則需要物理方法的連接,這就對單個細胞的操控提出了新的需求。因此,彩科(蘇州)生物科技有限公司提出了能夠實現單細胞多組學的平臺畫像:


  • 對成千上萬個單細胞進行高度并行的自由操作,包括特定的細胞導入和導出

  • 可以對細胞進行多維度的成像和實時監控,具有多個熒光通道,可實現多個蛋白的檢測。

  • 高通量并行的單細胞可以實現長時間的培養及換液

  • 能夠對高通量的單細胞進行染色,清洗

  • 可以并行導入高通量的單個磁珠同細胞配對,以捕獲各種組學信息

  • 能夠對某些感興趣的細胞進行分選導出分析其各種組學信息

多組學量身定制-光電鑷千變萬化

目前,對于單細胞的檢測系統而言,樣本從常規的組織變成了單個細胞,這就對檢測靈敏度提出了新的要求,而微流控技術以其極小的反應體積,大大提高檢測靈敏度,同時減小前處理中操作者帶來的誤差。微流控中單細胞操控的技術非常豐富,各種物理場都有很好的應用,包括通過流體驅動的單細胞阱、微閥門形成的單獨反應器、電鑷、光鑷以及聲鑷等。



單細胞分析的本質,就是將單個細胞獨立分隔,目前常用的兩類方案為微陣列和微孔。微孔陣列在基因測序和單分子蛋白檢測中都有應用,基因測序的主流方法是邊合成邊測序(Sequencing By Synthesis),在合成的過程中檢測堿基的信號,無論何種信號的檢測,都對微流控芯片提出了兩個要求,分別是物理分隔的反應位置和可連續進行反應(Sequential Reaction),微孔陣列不僅可以通過泊松分布實現微球和細胞配對,也可以通過液體交換對細胞進行染色等反應進行實時監測,但由于微孔只有物理分隔的作用,對于細胞的提取復雜繁瑣;而采用油包水的液滴方案,將液滴和微球等反應物包裹在液滴中同樣達成了物理上的分隔,而且可以使用流體或電場控制液滴通過控制液滴的移動來控制細胞的移動,這樣可以解決微孔陣列中無法操控細胞的問題,卻失去了連續反應的能力。由于水相反應物都被包裹在油中,如果需要增加反應物要在液滴的芯片上做液滴的融合,如果需要徹底改變反應物,則需要破乳后重新形成液滴,理論上雖然可以實現,但從產品化的角度,每一種不同的應用或細微的改變都需要重新設計液滴芯片并進行大量工程驗證優化等工作,難以實現單細胞多組學上多樣的應用需求。


液滴的方法中有一種基于介電潤濕的數字微流控技術,利用介電潤濕效應驅動液滴動作的原理在于通過對嵌在介電層下的微電極陣列施加電壓來改變介電層與附著于其表面導電液滴間的潤濕特性,使液-固接觸角發生變化,造成液滴兩端不對稱形變,促使液滴內部產生壓強差,從而實現對液滴變成或運動的操作與控制。注意,介電潤濕的技術在于移動液滴,通過移動包裹細胞的液滴來移動細胞。因此,同樣存在液滴捕獲細胞的問題,單細胞的捕獲一方面可以通過有限的對稱分裂實現,也可以搭載十字油包水的液滴擠出系統(液滴數字微流體ID2M)實現,前者步驟繁瑣,而后者依賴于泊松分布,捕獲效率低下,加之可變液滴的移動穩定性尚待研究,數字微流體在高通量單細胞分析上不占優勢。


最終,基于光電鑷的技術,通過可見光照射光敏材料誘導產生非均勻電場介電泳力, 推動Beads或細胞移動。這個方法可以結合上述方法中的優勢,通過對***以上的光敏像素點的數字化控制,可以實現直接對于細胞和Beads的高度并行操控,同時可以對細胞的環境進行換液加樣,進行連續的多種的反應,并通過成像方式實時監測細胞狀態和增殖情況。


目前,國內**擁有該技術的是彩科(蘇州)生物科技有限公司(以下簡稱:Lychix彩科生物)。


單細胞光導系統TARS

&

光導芯片Partition


Lychix彩科生物單細胞光導系統TARS,基于高度集成的納升級細胞微環境光電芯片,實現了高通量單個細胞的顯微成像,高自由度單個細胞的并行操控,高效率的細胞生長環境的液質及氣體的交換,細胞長時間的培養追蹤,以及任意視野下,指定細胞的自動分選導出,為廣泛的科研工作者提供了細胞操作分析分選相關的一系列的完整解決方案,能夠使科研用戶在芯片上輕松獲得單個克隆/細胞,對單個克隆/細胞進行在單細胞水平下進行一系列的基于如細胞形態,細胞基因組學,功能表型的豐富的研究方案,同時科研完成特異性細胞亞群的分選富集,高產細胞系的回收和放大,目標細胞的生物學的功能研究。


單細胞光導系統TARS科研廣泛應用于單細胞多組學研究,抗體發現、抗體工程研究,工程細胞株篩選,T細胞功能研究/TCR-T篩選,功能基因組學/CRISPR 篩選,腫瘤免疫治療研究,干細胞分離分化研究,類器官拓展研究以及合成生物學等領域。



以上就是我們對單細胞多組學的應用前景和硬件需求的分享,限于篇幅原因,很多方法和應用案例無法完全展示,歡迎聯系Lychix彩科生物作進一步交流。


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文章來源:彩科生物


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廣交會展館C區15.1館  
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